FUSIÓN DE PROTOPLASTOS DE LEVADURA PARA USO INDUSTRIAL

Ricardo Niño Castañeda
ricardonino50@yahoo.com

La definición de protoplasto es el primer cuerpo organizado de una especie. En 1892 se obtuvo el primer protoplasto vivo de cebolla. La fusión de protoplastos sirve para obtener nuevos híbridos, para estudios fisiológicos, bioquímicos, eliminación y biogénesis de la pared celular. La fusión de protoplastos puede ser intraespecífica  del mismo género e interespecífica de diferentes géneros.
Para realizar una hibridación (Uso industrial)  se deben utilizar levaduras que estén en el proceso realizando una biotransformación y otra levadura de laboratorio que tenga las características que no posee la levadura del proceso.
El procedimiento para realizar la fusión de protoplastos se inicia teniendo en cuenta los tiempos (hr) de crecimiento de las levaduras de proceso y de laboratorio que necesitan cada una de ellas para llegar al final de la  fase exponencial. Estas levaduras  se deben  crecer utilizando el medio YPD y colocarlas en un agitador a 220 rpm y 30ºC;  al finalizar  la fase exponencial, se cosechan por centrifugación.
El segundo paso, es el pretratamiento a las levaduras cosechadas anteriormente, utilizando  el buffer de pretratamiento isoosmótico (Triz-HCl, EDTA y KCl) adicionando  Betamercaptoetanol que ayuda a romper los enlaces  sulfuro de las proteínas de la pared celular. Los tubos  con las levaduras se  con KCl y es para proteger al protoplasto.
El tercer paso consiste en adicionar a las levaduras anteriores   el buffer isoosmótico (Fosfato Citrato, KCl) de lisis con  las enzimas para realizar la  lisis o eliminación de la pared celular. Aquí se utiliza el agitador a 220 rpm a 37ºC. Al finalizar este tiempo se lavan los protoplastos unas 4 o 5 veces con el buffer de pretrat. sin beta-m  con el fin de evitar la acción de las enzimas y tenemos los verdaderos protoplastos.
A continuación se realiza  la inducción de la fusión de los protoplastos de las levaduras   utilizando el buffer de fusión (PEG, CaCl2, DMSO). Esta fusión se realiza en la incubadora a 30ºC y 30 min. Terminado el tiempo de fusión se siembran en cajas de petri con  el medio OSY isoosmótico (YPD, KCl) y se llevan a la incubadora a 30º C 24 – 36 hr.
Después del crecimiento de las colonias se realiza la selección de los  nuevos hibridos. Se observan y se aislan las colonias más grandes y se transfieren con una asa al medio YPD en caja de petri, nuevamente a la incubadora y serán estas   las colonias  que se podrán analizar para verificar si este nuevo híbrido posee las características deseadas que no tenía ía la levadura de proceso. 
Los ensayos son análisis bioquímicos de osmotoleracia, curva de crecimiento en laboratorio y en planta y estudio del cariotipo en electroforesis en gel de campo pulsado.