USO DE LA INGENIERIA METABOLICA PARA INCREMENTAR LA PRODUCTIVIDAD DE ETANOL

Vásquez Jorge Alberto 1*  Castaño, Hader Ivan2 Marin, Paula A3. Arango, Rafael 4.
1. Master en Biotecnología Universidad de Antioquia. Estudiante de: doctorado en Biotecnología UdeA. Doctorado en Ingeniería con énfasis en alimentos Universidad del Valle. jvasquez@cenicana.org , jorvasco1@gmail.com.  2. Escuela de Microbiología UdeA. 3. Ingeniera Biológica Universidad Nacional de Medellín. 4. Director grupo de Biotecnología Vegetal Corporación Para Investigaciones Biológicas de Medellín.

La adición de etanol en un 10% o más, ayuda a completar la combustión de la gasolina y a reducir la cantidad de gas que causa el efecto invernadeo y otras emisiones contaminantes. En varios estudios se ha demostrado que el flujo fermentativo en algunas bacterias tiene mayor concentración final de etanol, rendimiento y productividad volumétrica (P = 41.6g/L; Yp/s=0,43g/g; Qp= 0.87g/L/h) que S. cerevisiae (P = 35.2g/L; Yp/s=0,38g/g; Qp= 0.73 g/L/h). La mayor productividad bacteriana obedece a la alta afinidad por los sustrato piruvato y acetaldehído/ NADH de las enzimas Piruvato Descarboxilasa (PDC) y Alcohol Deshidrogenasa (ADHII) respectivamente. 

Debido a que la afinidad por los sustratos de las enzimas PDC y ADHII bacterianas es mucho más alta que la de las enzimas de la ruta fermentativa de S. cerevisiae, su correcta expresión en la levadura permitiría dirigir el metabolismo oxidativo hacia una mayor productividad de etanol. 

En este estudio se realizó la clonación y coexpresión de los genes pdc y adh II de Z mobilis en S. cerevisiae usando promotores fuertes como el de las enzimas Fosfoglicerato kinasa (PGK) y la Alcohol Deshidrogenasa I (ADHI) respectivamente. Con la ayuda de programas de bioinformática se diseñaron genes con codones optimizados para la expresión en S. cerevisiae los cuales se construyeron mediante  fusión génica por PCR. Los genes optimizados fueron clonados en el vector integrativo de levaduras pRS406 para generar los plásmidos CIBI (Zmpdc+) y CIBII (Zm pdc + adhII+), con los cuales se transformó la cepa S. cerevisae GG570 (PDC∆-) por medio de electroporación. La verificación de integración al genoma se realizó haciendo extracción de ADN genómico en las levaduras transformantes  y una PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) con dos juegos de iniciadores, uno para el gen completo y otra anidada para una región central. La evaluación de la expresión se realizó por la técnica RT-PCR. Los parámetros cinéticos de las cepas recombinantes S. cerevisiae GG570 CIBI, GG570 CIBII resultantes y el control CBS8066 se evaluaron mediante fermentaciones a escala de laboratorio. Los productos y subproductos de las fermentaciones se  analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Se observaron diferencias significativas en producción final de etanol a favor de la cepa GG570-CIBII que porta los dos genes PDC y ADHII optimizados para la expresión en Saccharomyces, esta cepa produjo 34.2 g/l de etanol a las 16 horas y  mientras que la cepa GG570-CIB I tuvo una producción final de etanol de 26g/l a las 24h, similar a la cepa control  CBS8066 que tuvo 25,5 g/l de etanol a las 24 horas de fermentación.

Se observó un redireccionamiento del flujo de carbonos hacia una mayor productividad de etanol en las cepas GG570 CIBII que expresan los genes PDC y ADHII optimizados, con un incremento en 34% en la concentración final de etanol y 0,66 g/L/h en la productividad volumétrica a las 20h.